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酶联免疫吸附测定技术专题

酶联免疫吸附测定技术专题

导读

酶联免疫吸附测定法,简称ELISA,是实验室最常用的检测方法。 ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后,既不影响抗原抗体反应的特异性,也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点。

技术简介

酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay),简称ELISA,是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质,其催化效力超过目前所有人造催化剂。ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后,既不影响抗原抗体反应的特异性,也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点,适合于大批标本的检测,广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。

核心原理
ELISA必须遵守以下3个核心原理:1)抗原或抗体能吸附于固相载体表面,并保持其免疫学活性;2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,可根据已知浓度的抗原或抗体的颜色反应的深浅绘制标准曲线并依此计算出未知样品中抗体或抗原的浓度。在ELISA中酶起到很关键的作用,常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化物酶为多。酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还能催化酶促反应,显示出生物放大作用。
 

应用方向

ELISA应用的范围很广,而且正在不断地扩大,原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原,可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可用于疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此,它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。按照待测物性质的不同,ELISA反应可以分为抗原检测反应及抗体检测反应。

在医学领域上,能够进行检测的抗原包括:内分泌方面的雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等,血液学方面的凝固因子(如第Ⅷ凝固因子)、红细胞抗原及结合球蛋白(Hapto Globin)等,肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白(AFP)癌胚抗原(CEA),此外还有霍乱弧菌、大肠肝菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素;脑膜炎球菌及淋球菌抗原;检测免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原,检测病人或病兽的粪便中的轮状病毒;检测甲肝病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等。

而用ELISA检测抗体,已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断,亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面,它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断,这对人医和兽医都很重要。在病原微生物方面已用于检测链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体,还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体作诊断,也可用于对立克次氏体的种属鉴别,还有用于检测鹦鹉热衣原体抗体的报导。ELISA也可应用于以下病毒抗体检测:流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等,其敏感性都超过目前常用的检测方法。此外,还可用于鉴定病毒型别,例如疱疹病毒。在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断,例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体,红斑性痕疮抗体等等。在卫生学方面,可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。 

双抗体夹心法检测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,但要注意的是在一步法(待测抗原与酶标抗体一起加入反应)测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”出现钩状效应,甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。

双抗体夹心法的简要操作步骤为:

1) 先加入抗体,使抗体固定结合于载体表面;

2) 再加样品,使目标检测抗原形成抗原-抗体复合物;

3) 加酶标抗抗体(第二种动物抗抗原的酶标抗体);

4) 加入酶促反应底物,发生显色反应,显色的深浅与待测抗原的量成正比。

图1 双抗体夹心法测抗原流程示意图 
竞争法检测抗原
当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。方法的基本原理可见图2,经洗涤后分成两组:一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液,而另一组只加酶标记抗原,再经孵育洗涤后加底物显色,这两组底物降解量之差,即为所要测定的未知抗原的量。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

竞争法的简要操作步骤:

1) 先加入抗体,使抗体固定结合于载体表面;

2) 加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗原混合物,同时做只加酶标抗原的对照组;

3) 加入酶促反应底物,发生显色反应,对比实验组及对照组的显色差异,计算未知抗原的量。

图2 竞争法测抗原流程示意图

双抗原夹心法检测抗体

双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。

双抗原夹心法的简要操作步骤为:

1) 先加入抗原,使抗体固定结合于载体表面;

2) 再加样品,使目标检测抗体形成抗原-抗体复合物;

3) 加酶标抗原;

4) 加入酶促反应底物,发生显色反应,显色的深浅与待测抗体的量成正比。

图3 双抗原夹心法测抗体流程示意图 
间接法检测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体(人免疫球蛋白),故称为间接法。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法的简要操作步骤:

1) 将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原;

2) 加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗-体复合物;

3) 加酶标抗抗体;

4) 加入酶促反应底物,发生显色反应,显色的深浅与待测抗体的量成正比。

图4 间接法测抗体流程示意图 
竞争法检测抗体
竞争法测抗体的反应模式与竞争法测抗原类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

竞争法的简要操作步骤:

1) 先加入特异性抗原,使抗原固定结合于载体表面;

2) 加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗体混合物,并做只加酶标抗体的对照组;

3) 加入酶促反应底物,发生显色反应,对比实验组及对照组的显色差异,计算未知抗体的量。

图5 竞争法测抗体流程示意图 
捕获包被法检测抗体
捕获包被法(亦称反向间接法)ELISA,主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定。以目前最常用的IgM测定为例,因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在,则后者可干扰IgM的测定。因此先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再测定特异性IgM。IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

捕获法测抗体的简要操作步骤:

1) 特异性捕获抗体的包被,先把能特异性结合待测抗原的抗体固定于固相载体表面;

2) 加入待测样品,通过固定在载体表面的针对该抗原的抗体固定于载体表面;

3) 加入特异性抗原以及针对该特异性抗原的酶标抗体;

4) 加入酶促反应底物,发生显色反应,显色的深浅与待测抗体的量成正比。

图6 捕获包被法测抗体流程示意图
ABS-ELISA法
除以上6种ELISA测试方法外,近年在亲和素-生物素系统上又发展出ABS-ELISA法 。亲和素是一种糖蛋白,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成,生物素为小分子化合物。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与抗体或酶形成生物素标记产物,标记方法颇为简便,并且不影响抗体或酶原有的生物学活性。亲和素生物素系统,简称ABS(avidin-biotin system)。由于亲和素与生物素间的亲和力极强,结合迅速,且极其稳定,使BAS标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度,为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径,大大提高了检测的灵敏度,但该方法比普通ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,因此在临床检验中ABS-ELISA应用不多。ABS-ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。

在LAB法中,将特异性抗体生物素化、酶分子标记在亲和素分子上,生物素化抗体与被检抗原结合后,再借BAS的高度亲和力将酶分子联结到抗原分子上,经酶促反应即可检出抗原,因此提高检测的敏感度。

图7 ABS-ELISA法中的LAB法
ABC法同样将特异性抗体生物素化、酶分子标在生物素上,亲和素和酶标生物素需要先按一定比例形成ABC复合物,这种网络结构结合了大量的酶分子,当亲和素尚未被酶标生物素饱和时,生物素化抗体即可与之结合, 使被检抗原、生物素化抗体和酶标生物素联成一体。
图8 ABS-ELISA法中的ABC法 
常见问题及解决
1. 阴性对照出现阳性结果,造成该现象的原因有4个:

1)试剂或样品可能被污染,或者由于孔之间的溅洒出现交叉污染。——应当更换使用试剂,小心操作;

2)酶标板洗板不彻底。——尝试用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤,洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净;

3)抗体量过多导致非特异结合。——应该根据推荐用量使用抗体,尽量使用较少的抗体;

4)夹心法、捕获法中检测抗体与包被抗体/抗原反应。——确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体,两者之间不会互相反应。

2. 酶标板整体背景高,造成该现象的原因有4个:

1)抗体非特异性结合。——应确保进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液,最好使用5%~10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清,确保板孔经过预处理以防止非特异结合,使用亲和力强、纯度高的抗体,最好经过了预吸收处理;

2)底物结合浓度过高或反应时间过长。——应调整底物的浓度,当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应;

3)底物溶液不新鲜或被污染。——应检测底物溶液,正常的底物溶液应该是清亮透明的,如果变黄或其他颜色则是被污染的标志;

4)底物孵育过程没有避光。——底物孵育应该在避光环境下进行。

3.吸光度数值偏高或偏低,造成的该现象的原因有4个:

1)样品中待检抗原含量太低会导致测试结果偏低。——可尝试增加样品的使用量或者更换一个检测更灵敏的方法;

2)加入抗体量不合适也会造成结果偏低或偏高——应确定使用的是建议抗体用量,或者为了使结果更好尽可能调整抗体的最适用量;

3)孵育时间不够长会导致检测结果偏低。——应适当延长抗体或抗原的孵育时间,确保待测样品与检测抗体能充分结合;

4)孵育温度不适合。——应保证抗体在最适宜并且稳定的温度下孵育,一般是室温(25度)。

 
 

 


 

 

 

 

 

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